| Title | QUANTIFICAZIONE DELLE CELLULE BATTERICHE ASSOCIATE A SEDIMENTO FLUVIALE MEDIANTE MICROSCOPIA AD EPIFLUORESCENZA E CITOMETRIA A FLUSSO |
| Abstract | La quantificazione dell'abbondanza batterica negli ambienti acquatici è un parametro di base per comprendere il ruolo delle comunità microbiche nei processi ecosistemici. Negli ultimi anni, le misure di abbondanza sono principalmente effettuate utilizzando la microscopia ad epifluorescenza e la citometria a flusso, associate all'utilizzo di coloranti
fluorescenti specifici per la marcatura degli acidi nucleici cellulari. Tuttavia, quando i microrganismi sono associati ai sedimenti di fondo, l'applicazione di questi metodi è resa problematica dalla presenza di particelle di detrito e di materiale organico che possono mascherare il segnale fluorescente specifico delle cellule (Daims e Wagner, 2007;
Rogers et al., 2007). In molti casi la semplice diluizione del campione trattato è sufficiente per ottenere una chiara identificazione cellulare. Tuttavia nei sedimenti, soprattutto in quelli fini o argillosi, la diluizione è spesso inefficace, dal momento che l'abbondanza delle particelle di detrito può essere più elevata di diversi ordini di grandezza
rispetto a quella batterica. In questi casi, è quindi necessaria la messa a punto di una procedura di separazione delle cellule dal sedimento. Fino ad oggi sono stati proposti diversi metodi per l'estrazione e la conta diretta delle cellule associate a diverse matrici ambientali, principalmente suolo ma anche sedimenti fluviali ed aggregati organici
Non si è tuttavia pervenuti ancora ad una procedura standardizzata, soprattutto per quanto riguarda il sedimento di ambienti fluviali, poiché la sua matrice è particolarmente complessa. Generalmente i metodi di estrazione utilizzano una combinazione di trattamenti chimici e fisici al fine di ottenere il distacco delle cellule dal substrato, senza
influenzare l'integrità delle membrane cellulari. In particolare, dal punto di vista chimico, agenti chelanti quali sali di sodio (ossalato, pirofosfato, citrato) e resine (es. amberlite) sono molto utilizzati per indebolire i legami idrogeno e le forze elettrostatiche che legano insieme cellule e particelle di detrito. L'utilizzo di questi composti in associazione con
tensioattivi (Sodio-dodecilsolfato, Sodio-colato, Tween-Series, Triton-X) si è dimostrato particolarmente efficace nel separare in modo ottimale le cellule dal detrito (Katayama et al., 1998). Dal punto di vista fisico, il distacco delle cellule viene normalmente effettuato tramite strumenti quali vortex, agitatori, miscelatori, bagni e sonde ad ultrasuoni. Una volta staccate le cellule dalle particelle si procede alla fase di separazione. Diversi Autori hanno suggerito di impiegare la centrifugazione su gradiente di densità, utilizzando una soluzione non-tossica a concentrazione nota di Nycodenz. Il Nycodenz è un derivato dall'acido benzoico, tradizionalmente utilizzato in campo biomedico per la separazione di particelle biologiche in vitro. |
| Source | Notiziario dei metodi analitici (Online) 12, pp. 19–23 |
| Journal | Notiziario dei metodi analitici (Online) |
| Editor | IRSA, Roma, Italia |
| Year | 2009 |
| Type | Articolo in rivista |
| Authors | Amalfitano S.; Fazi S.; Zoppini A.; Puddu A. |
| Text | 182099 2009 Google Scholar http //www.irsa.cnr.it/Docs/Notiz/notiz2009_%2812%29.pdf QUANTIFICAZIONE DELLE CELLULE BATTERICHE ASSOCIATE A SEDIMENTO FLUVIALE MEDIANTE MICROSCOPIA AD EPIFLUORESCENZA E CITOMETRIA A FLUSSO Amalfitano S.; Fazi S.; Zoppini A.; Puddu A. Istituto di ricerca sulle acque La quantificazione dell abbondanza batterica negli ambienti acquatici e un parametro di base per comprendere il ruolo delle comunita microbiche nei processi ecosistemici. Negli ultimi anni, le misure di abbondanza sono principalmente effettuate utilizzando la microscopia ad epifluorescenza e la citometria a flusso, associate all utilizzo di coloranti fluorescenti specifici per la marcatura degli acidi nucleici cellulari. Tuttavia, quando i microrganismi sono associati ai sedimenti di fondo, l applicazione di questi metodi e resa problematica dalla presenza di particelle di detrito e di materiale organico che possono mascherare il segnale fluorescente specifico delle cellule Daims e Wagner, 2007; Rogers et al., 2007 . In molti casi la semplice diluizione del campione trattato e sufficiente per ottenere una chiara identificazione cellulare. Tuttavia nei sedimenti, soprattutto in quelli fini o argillosi, la diluizione e spesso inefficace, dal momento che l abbondanza delle particelle di detrito puo essere piu elevata di diversi ordini di grandezza rispetto a quella batterica. In questi casi, e quindi necessaria la messa a punto di una procedura di separazione delle cellule dal sedimento. Fino ad oggi sono stati proposti diversi metodi per l estrazione e la conta diretta delle cellule associate a diverse matrici ambientali, principalmente suolo ma anche sedimenti fluviali ed aggregati organici Non si e tuttavia pervenuti ancora ad una procedura standardizzata, soprattutto per quanto riguarda il sedimento di ambienti fluviali, poiche la sua matrice e particolarmente complessa. Generalmente i metodi di estrazione utilizzano una combinazione di trattamenti chimici e fisici al fine di ottenere il distacco delle cellule dal substrato, senza influenzare l integrita delle membrane cellulari. In particolare, dal punto di vista chimico, agenti chelanti quali sali di sodio ossalato, pirofosfato, citrato e resine es. amberlite sono molto utilizzati per indebolire i legami idrogeno e le forze elettrostatiche che legano insieme cellule e particelle di detrito. L utilizzo di questi composti in associazione con tensioattivi Sodio dodecilsolfato, Sodio colato, Tween Series, Triton X si e dimostrato particolarmente efficace nel separare in modo ottimale le cellule dal detrito Katayama et al., 1998 . Dal punto di vista fisico, il distacco delle cellule viene normalmente effettuato tramite strumenti quali vortex, agitatori, miscelatori, bagni e sonde ad ultrasuoni. Una volta staccate le cellule dalle particelle si procede alla fase di separazione. Diversi Autori hanno suggerito di impiegare la centrifugazione su gradiente di densita, utilizzando una soluzione non tossica a concentrazione nota di Nycodenz. Il Nycodenz e un derivato dall acido benzoico, tradizionalmente utilizzato in campo biomedico per la separazione di particelle biologiche in vitro. 12 http //www.irsa.cnr.it/ShPage.php lang=it pag=nma QUANTIFICAZIONE DELLE CELLULE BATTERICHE ASSOCIATE A SEDIMENTO FLUVIALE MEDIANTE MICROSCOPIA AD EPIFLUORESCENZA E CITOMETRIA A FLUSSO Amalfitano_notiz2009 1.pdf Articolo in rivista IRSA 1974 8345 Notiziario dei metodi analitici Online Notiziario dei metodi analitici Online Not. metodi anal. Online Notiziario dei metodi analitici. Online stefano.amalfitano AMALFITANO STEFANO stefano.fazi FAZI STEFANO alberto.puddu PUDDU ALBERTO annamaria.zoppini ZOPPINI ANNAMARIA TA.P02.002.003 Ruolo di comunita microbiche nella degradazione della sostanza organica e nella circolazione del carbonio nei sistemi acquatici |
